文献分享| 双通道荧光化学传感器的构建及其靶向线粒体的生物成像应用

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▉ 导语

今天给大家分享一篇全北国立大学Dong Jin Yoo团队发表在期刊 Analytica Chimica Acta 上的文献：Construction of a simple dual-channel flfluorescence chemosensor for Cu2þ ion and GSSG detection and its mitochondria-targeting bioimaging applications

摘要

在这项工作中，制造了一种简单的萘醌线粒体靶向化学传感器(CIA)，用于在缓冲半水溶液中通过“开-关”模式同时检测Cu²⁺和GSSG（氧化的谷胱甘肽）。CIA化学传感器对Cu²⁺和GSSG表现出敏感的检测响应，检测限较低(分别为0.309 μM和0.226 μM)。此外，CIA被用作序列荧光生物标志物来检测人宫颈癌细胞系中的Cu²⁺。研究结果表明，CIA可以区分人类癌细胞和正常细胞。CIA具有靶向线粒体的能力。CIA化学传感器能在斑马鱼幼虫中检测到Cu²⁺，表明该探针具有组织穿透能力。

设计方案

萘醌衍生物由多种功能单元组成，当与合适的分析物配合时，具有很强的荧光。此外，萘醌具有良好的溶质变色性能和摩尔吸收系数，对活细胞毒性低。在这里，描述了一种新的荧光化学传感器5-(3-chloro-1,4-dioxo-1,4-dihydronaphthalen-2-yl)amino)isophthalicacid，CIA)，用于在缓冲半水溶液(H2O/MeOH，1：1，v/v，20mM HEPES，pH=7.5)溶液中同时检测Cu2+和GSSG。根据酸碱概念，Cu2+是一种亲电强的边缘酸；因此，它有望与亲核官能团形成金属键，如氧原子。设计的化学传感器由2、3-二氯-1、4-萘醌（1)和5-氨基异酞酸(2）合成，见方案1。

方案1 CIA化学传感器的合成

CIA对金属离子的荧光选择性研究

为了确定CIA的吸收行为，在各种半水有机溶剂中记录紫外/可见光谱。所得到的光谱在230、282和490nm处有三个吸收最大值，对应于π-π*和n-π*跃迁态。CIA在缓冲的H2O/MeOH溶液中表现出良好的吸收行为和良好的溶解性。用不同金属离子在缓冲半水溶液中筛选了CIA的金属离子结合特性，发现CIA对这些离子没有明显的金属结合和荧光增强。相比之下，当Cu2+添加到CIA中时，由于基质复合物的形成和分子内电荷转移(ICT)效应，荧光发射增加了43倍（图 1）。 

图 1.在缓冲半水溶液中加入各种阳离子(2.5 μM)后，CIA(1.25 mM)的阳离子结合分析

从图2可以看出，由于形成的基质复合物和诱导的ICT效应，荧光信号的强度随着Cu2+的增加而稳步增加。滴定分析表明传感过程很敏感，CIA-Cu2+复合物的线性关系具有良好的回归值(R²=0.9933)。在CIA溶液中加入100个等量的Cu2+后，荧光信号的放大完全停止，这表明CIA-Cu2+复合物达到了最大饱和水平。

图 2.在缓冲半水溶液中加入Cu2+(0 M - 0.625mM)的CIA(12.5 μM)的荧光发射滴定检测

结合比和缔合常数的测定

CIA - Cu2+配合物中获得的结合比为1：1。计算出的Ks值为5.0×10⁵ M^-1。确定的LOD为0.309 μM，明显低于世卫组织关于饮用水和人类血液中的可接受Cu2+水平的建议。

CIA的可逆性分析

通过添加EDTA来测试CIA的再生能力。虽然荧光发射随着Cu2+的加入而增强，但随后加入EDTA使发射信号被猝灭和逆转（图 3）。这一可逆性研究表明，所构建的CIA化学传感器具有高贵的可逆性；因此，该探针可以进行各种环境和生化分析。

图 3.CIA(12.5 μM)与Cu2+(312.5 μM)和EDTA(0.5 mM)在缓冲半水溶液中的可逆性研究

CIA - Cu2+金属配合物的FT-IR分析

为了验证所获得的配位结合机制和官能团的参与，对CIA、CuSO4·5H2O和CIA - Cu2+金属配合物进行了FT-IR研究。如图4所示，在CIA的间苯二酸单位中，分别从-C=O和-CH组获得1683和2816 cm-1的清晰红外信号。在CIA加入Cu2+后，-C=O组和-CH组的红外信号发生了重大变化，分别被红色转移到1685和2854cm-1。值得注意的是，由于与-C=O基团建立了配位键，加入Cu2+后，在1713cm-1处出现了一个新的红外信号。在分子中诱导各向异性或环电流效应；因此，在间苯二酸单元中的-C=O部分之间的-CH基的红外信号也发生了改变。因此，对CIA - Cu2+金属复合物的FTIR研究表明，Cu2+的结合是通过CIA间苯二酸单位中的-C=O基团完成的。

图 4.CuSO4·5H2O、CIA和CIA - Cu2+金属配合物的FT-红外分析

NMR滴定研究

为了更深入地了解CIA - Cu2+复合物的结合机制，在DMSO-d6中进行了1H NMR和13C NMR滴定分析。在CIA间苯二酸单元的-C=O部分之间，-CH基团在8.2035ppm处观察到一个明确的三联体质子信号。在CIA溶液中加入Cu2+的量增加后，-CH基团的三重质子信号强度显著降低，出现为一个较宽的单线态峰。当CIA加入Cu2+ 0.1当量时，最大信号强度减弱。此外，-CH峰值的上游信号位移从8.2035到8.1839ppm，而在CIA的剩余官能团中没有观察到剧烈的位移或峰值减少。这种显著的峰变化是由分子中的诱导环电流或各向异性效应引起的(图 5a)。随后，进行了13CNMR滴定研究，以确定CIA中其他基团对Cu2+的参与。如图5b所示，CIA间苯二酸单元的-C=O部分在166.9592ppm处获得了一个形成良好的、强烈的碳信号。随着在CIA溶液中加入Cu2+，-C=O组的信号强度明显降低。当加入0.01当量的Cu2+时，在间苯二酸单元上，-C=O基团的最大碳信号消失。此外，在间苯二酸单元的-C=O部分之间的128.2753ppm处的碳信号减少并消失。此外，由于CIA的诱导环电流或各向异性特性，在125.7603、131.5496和140.2670ppm处的碳信号消失。即使在添加了更高浓度的Cu2+后，其他的碳信号也没有发生改变。因此，这些累积的核磁共振滴定分析证实了CIA间苯二酸单元的-C=O基团参与了与Cu2+的结合。

图 5.(a)在DMSOd6溶液中加入(i)0.0(ii)0.02(iii)0.04（iv）0.06(v)0.08和(vi)0.1当量的Cu2+后CIA的1HNMR滴定分析。(b)在DMSOd6溶液中加入(i)0.0(ii）0.01(iii)0.02和(v)0.1等量Cu2+的13CNMR滴定分析。

量子化学(DFT)研究

研究了CIA - Cu2+复合物在LUMO和HOMO水平上的电子排列。在LUMO处，能量的定位均匀分布在整个金属配合物中。然而，在HOMO状态下，部分能量分布向眼内视距间苯二酸-Cu2+区域移动，能量变化为0.896eV。CIA与CIA - Cu2+系统之间的能量差显著降低了2.004eV，表明CIA与Cu2+形成了更稳定的配位配合物。这些发现与金属配合物中ICT效应的存在相一致（图6）。

图 6.(a)CIA和(b)CIA - Cu2+系统的LUMO和HOMO能量分布

方案2提出了CIA与Cu2+的结合机制

方案2 CIA对Cu2+和GSSG的合理检测机制

CIA-Cu2+复合物对GSSG识别的荧光研究

将各种类型的氨基酸和肽，添加到含有CIA-Cu2+复合物的溶液中。随后的荧光发射研究表明，所使用的分析物与CIA-Cu2+复合物没有显示出任何显著的结合亲和力。然而，在CIA溶液中加入L-氧化谷胱甘肽(GSSG)后，荧光强度明显被猝灭，而没有改变峰的位置(图 7a)。为了进一步研究这种效应，进行了荧光滴定分析来阐明CIA-Cu2+复合物在分子水平上对GSSG的电子行为(图 7b)。随着CIA-Cu2+配合物中加入GSSG浓度增加，荧光信号强度逐渐猝灭，具有良好的线性关系曲线(R2=0.9905）。GSSG产生的荧光猝灭是通过以下重要机制获得的：(i)GSSG可以通过取代配位水分子，直接对二价铜离子发生反应；(ii)GSSG可能作为增敏剂或作为猝灭部分，如果铜离子具有不饱和配位环境的话；(iii)CIA的单线态或三重态可能受到添加GSSG的光物理特性的影响。此外，研究发现其他氨基酸和肽的存在并不影响CIA-Cu2+复合物对GSSG的感知。因此，所制备的CIA-Cu2+体系在缓冲半水溶液中具有较高的GSSG识别能力。随后，利用Job的图调查来确定所获得的用于GSSG检测的CIA-Cu2+配合物的配位化学计量学。结果表明，得到的配合物的化学计量比为1：1。测定的Ks值为2.5×105M-1。LOD为0.226 μM，低于人类细胞和组织中允许的GSSG水平(5mM)。最后，探讨了CIA-Cu2+配合物与GSSG的可逆性。在CIA溶液中交替加入Cu2+和GSSG可以同时增强和猝灭荧光信号强度。

图7 （a）CIA-Cu2+的氨基酸和肽的选择性研究；（b）CIA-Cu2+的GSSG滴定分析

Cu2+和GSSG对CIA的表面形态学分析

为了研究Cu2+和GSSG结合对CIA的形态学改变，采用FE-SEM技术进行了表面分析（图8）。CIA的形态貌显示其表面由片状结构组成(图 8a)。有趣的是，用Cu2+处理的CIA显示出一个完全改变的表面结构。Cu2+颗粒与CIA混合良好，形成聚集的花状结构(图 8b和c)。CIA-Cu2+配合物的EDS元素分布表明Cu2+分散在CIA基质上(图 8d-h）。此外，还分析了CIA-Cu2+复合物与GSSG的形态学变化。扫描电镜图像显示，Cu2+粒子完全被肽GSSG覆盖(图 8i-l)。此外，EDS元素分析表明，所有元素均均匀分布在CIA的表面(图 8m-r）。更有趣的是，图。在159KX的高倍放大下记录了图8c，显示CIA-Cu2+复合物的表面不受高能电子束的影响。这表明该金属配合物具有较高的热稳定性，可应用于温度相关应用。因此，对CIA-Cu2+-GSSG结构的表面形态学研究表明了探针-金属-肽异质结构的生长，这表明了它们的结合亲和力和元素在CIA基质上的分布。这些发现支持了CIA对Cu2+和GSSG进行的荧光发射研究。

图 8.用Cu2+(1.25 mM)和GSSG(1.25 mM)对CIA(12.5 μM)进行FE-扫描电镜调查

对人类活细胞中Cu2+的显著跟踪

从ME180和SiHa细胞中获得了明亮的荧光发射响应，但从HaCaT和L929细胞中检测到了不显著的荧光信号(图 9)。此外，与SiHa细胞相比，ME180细胞的绿色通道荧光发射增加了1.24倍，而SiHa细胞红色通道的荧光发射是ME180细胞的1.09倍。最大的荧光信号来自细胞的细胞质。因此，所获得的生物成像结果表明，CIA穿透细胞壁，有效地检测到人类癌细胞中的Cu2+，表明与正常细胞相比，癌细胞中Cu2+的荧光识别增强。

图 9.HaCaT、L929、ME180和SiHa细胞的共聚焦荧光图像；激发波长：355、484和590nm（分别为蓝色、绿色和红色）。

CIA的线粒体定位

图10表明，CIA的绿色荧光图像与线粒体红色染料的红色荧光图像具有很好的定位性。此外，确定的共定位系数分别为0.860和0.956，表明CIA具有靶向ME180细胞线粒体的良好能力。

图 10.ME180细胞中CIA的线粒体细胞图像

斑马鱼幼虫的生物成像

斑马鱼幼虫在只有CIA或Cu2+孵育下没有荧光发射（图 11a-f），而同时与Cu2+和CIA孵育的斑马鱼幼虫发出了明亮的荧光信号(图 11g-i)。因此，这些发现证实了CIA具有良好的组织穿透能力，并可以在动物模型中检测Cu2+。

图11 斑马鱼幼虫中CIA与Cu2+参与下的成像

▉ 小结

本文制备了一种新的、易于合成的荧光化学传感器CIA，用于缓冲半水溶液中Cu2+和GSSG的双重检测。CIA对Cu2+和GSSG表现出较高的选择性、灵敏度、较低的生物毒性和快速的荧光响应。合成的CIA化学传感器被成功证明是检测人类活细胞和斑马鱼幼虫Cu2+的有效生物标志物，并且CIA证明了对人类癌细胞中Cu2+的鉴别检测和靶向线粒体的能力。

参考文献：

Ravichandiran, P.;  Prabakaran, D. S.;  Maroli, N.;  Boguszewska-Czubara, A.;  Maslyk, M.;  Kim, A. R.;  Chandrasekaran, B.; Yoo, D. J., Construction of a simple dual-channel fluorescence chemosensor for Cu(2+) ion and GSSG detection and its mitochondria-targeting bioimaging applications. Anal. Chim. Acta 2021, 1181, 338896.

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