研究开发基于多价适配体与CHA扩增的智能手机荧光/比色双模适配体传感器用于沙门氏菌检测

研究开发基于多价适配体与CHA扩增的智能手机荧光/比色双模适配体传感器用于沙门氏菌检测

沙门氏菌作为主要的食源性病原体之一，严重威胁公众健康并带来显著的经济负担。目前，该病原体的检测主要依赖于培养法、聚合酶链反应（PCR）以及酶联免疫吸附测定（ELISA）。虽然这些技术因其较高的可靠性和法规认可度而被广泛采用，但它们各自存在一定的局限性。例如，培养法耗时较长，通常需要数天才能获得结果，而PCR操作复杂，且对样品处理要求较高。ELISA虽然操作简便，但在复杂样品中灵敏度有限。这些不足推动了研究人员对更加快速、准确且适用于现场检测的新型传感系统的研究。

适配体作为一种具有高稳定性、低成本和易于修饰等优点的生物识别元件，已成为检测食源性病原体的理想候选材料。尽管近年来适配体传感技术取得一定进展，但其在复杂食品基质中的性能稳定性仍是阻碍其广泛应用的关键问题。为了克服这一挑战，研究人员探索了多价适配体结构，这种结构能够通过增强与靶标的结合能力，提高检测的灵敏度与抗干扰能力。尤其是基于DNA支架构建的多价适配体结构，因其结构可控、制备简便及可编程性强，近年来在食品病原体检测领域展现出广泛的应用前景。

系统设计原理

在本研究中，科研团队设计了一种基于四面体DNA纳米结构的多价适配体竞争探针，用于实现对目标细菌的高亲和识别，并在识别过程中释放大量cDNA片段。随后，释放出的cDNA通过催化发夹组装（CHA）过程进一步触发荧光与比色信号的产生，从而在双模式下实现灵敏检测。该系统还通过自校正机制对检测结果进行校准，提升了整体的检测精度。

图1. 智能手机集成的沙门氏菌荧光/比色双模适配体传感器检测原理示意图。

实验过程

1. 多价适配体竞争探针的构建与表征

研究人员通过琼脂糖凝胶电泳分析了四面体DNA纳米结构的自组装过程。结果显示，随着DNA单链的逐步添加，结构的迁移速度逐步减慢，表明四面体结构成功形成。随后，研究人员将适配体与cDNA结合至四面体DNA结构上，成功构建了多价适配体竞争探针。电泳结果显示，结合后的dsDNA结构迁移显著减慢，进一步验证了探针的成功组装。

为了进一步确认多价探针的形成，研究团队对水动力直径和zeta电位进行了测量。结果表明，四面体DNA结构在结合适配体和cDNA后，其尺寸和电荷分布均发生了显著变化，进一步佐证了多价适配体竞争探针的成功构建。此外，荧光显微镜和天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结果显示，与单价适配体相比，多价适配体探针对沙门氏菌的结合能力更强，信号输出更显著，说明其具有更高的亲和力和信号放大能力。

图1. 多价适配体竞争探针的合成与表征。（A）四面体DNA结构组装的电泳结果；（B）探针组装的电泳分析；（C）尺寸与zeta电位分布；（D）荧光显微镜下多价与单价适配体探针结合能力比较；（E）竞争反应的PAGE分析。

2. 双模催化发夹组装（CHA）系统的验证

为了评估CHA反应的可行性，研究团队通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳对反应过程进行表征。结果表明，在cDNA存在下，H1与H2能够形成稳定的异双链结构，并产生清晰的杂交条带，表明CHA反应能够被有效触发。此外，荧光和比色信号强度随着cDNA的加入显著增强，表明信号放大机制有效运作。

在荧光检测中，H1的荧光团由于发夹结构中的猝灭剂作用而处于淬灭状态，但在与cDNA结合后荧光信号恢复，说明结构被打开。而在比色检测方面，H2中富含G的序列原本处于封闭状态，但在CHA反应后被释放，形成具有过氧化物酶活性的G-四链结构，从而产生明显的比色变化。圆二色谱进一步验证了G-四链结构的形成，为系统性能提供了结构依据。

通过将多价适配体探针与CHA系统结合，研究人员验证了其在沙门氏菌检测中的有效性。结果表明，在目标细菌存在的情况下，荧光和比色信号均显著增强。此外，通过对比不同价态适配体探针的性能，研究发现随着价态增加，信号强度呈上升趋势，其中四价探针的信号比单价探针分别提高了约2.2和3.5倍。

图2. 双模CHA信号放大系统的验证。（A）CHA产物电泳结果；（B）荧光信号变化；（C）比色信号变化；（D）CD光谱分析；（E）沙门氏菌检测电泳结果；（F）信号增强效果评估。

3. 检测灵敏度评估

为了优化系统性能，研究人员对多个关键参数进行了系统评估，并确定了最佳实验条件。在最佳条件下，该系统能够在10 ~ 107 CFU/mL的范围内实现对沙门氏菌的有效检测。检测结果显示，荧光信号的线性关系良好（R² = 0.9891），检出限（LOD）为10 CFU/mL；比色信号的LOD为28 CFU/mL。此外，该方法在多种复杂食品基质中均表现出良好的稳健性，表明其适用于实际样品检测。

图3. 多价适配体辅助CHA法的检测灵敏度。（A）比色信号变化；（B）荧光信号变化。

4. 方法特异性测试

为评估该方法的特异性，研究人员在相同浓度下对六种常见食源性病原菌进行了检测。结果表明，非目标菌未引发明显信号变化，而沙门氏菌的荧光和比色信号显著增强，且混合菌样中信号强度与单一沙门氏菌接近，表明该系统具有高度的特异性。这一结果归因于多价适配体设计提升了与目标菌的结合选择性。

图3. 检测特异性分析。（C）比色信号；（D）荧光信号。

5. 智能手机集成检测设备的设计与应用

为了提升检测的便捷性与适用性，研究人员开发了一款基于智能手机的便携式检测装置。该装置采用3D打印技术制造，内置紫外和白光光源，以满足荧光与比色信号的最佳读取条件。设备内部配置镜面反射装置，确保均匀光照，并设有样品固定夹和观察窗口。研究人员还开发了一个名为“SalmoDetect RGB”的微信小程序，用于图像分析与浓度计算。

该小程序通过对图像中的颜色值进行建模，从每个样本中选取五个代表性点，进行RGB、HSV和CMYK等颜色模式分析，并计算欧几里得距离（ED）以评估信号强度变化。结果显示，ED（RGB）值与沙门氏菌浓度之间存在良好的线性相关性，从而实现了对目标菌的定量检测。

图4. 智能手机便携检测设备。（A）三维设计图；（B）实物图；（C）颜色点建模；（D）标准曲线；（E）检测应用示例；（F）检测信号相关性。

6. 实际食品样品中的沙门氏菌检测

为了验证该方法在实际样品中的适用性，研究团队在鸡肉、鳕鱼、鸡蛋和牛奶四种食品中进行了沙门氏菌检测。结果显示，荧光和比色信号的ED（RGB）值均随沙门氏菌浓度上升而成比例增加，表明系统在复杂基质中仍具有良好的响应性。此外，通过回收实验和盲样检测，研究人员验证了该方法的准确性与可靠性。与传统平板计数法和微孔板读数法相比，该系统的检测结果一致性强，相关系数均高于0.8，表明其具有较高的准确性与实用性。

该研究还表明，与传统实验室检测方法相比，该基于智能手机的传感器系统在成本方面具有显著优势，适用于资源有限或现场快速检测场景。

图5. 食品样品中的沙门氏菌检测。（A）荧光信号线性关系；（B）比色信号线性关系；（C）多方法检测结果对比热图。

总结

本研究成功构建了一种基于多价适配体与CHA扩增机制的智能手机双模适配体传感器，实现了对沙门氏菌的高灵敏、高特异性检测。该方法通过双重信号放大策略显著提升了检测灵敏度，同时结合双模检测与智能手机平台，增强了检测的准确性与便捷性。此外，该系统在多种复杂食品基质中均表现出良好的稳健性，为食品安全检测提供了新的技术手段。该研究不仅拓展了适配体传感技术的应用边界，也为推动低成本、高效率的食品检测系统发展提供了重要参考。

来源：TanC-Group