磷酸化抗体筛选遇假阳性？彩科生物LyTARS™平台高效化解
蛋白的磷酸化与非磷酸化形式差异较小，抗原表位单一。实际免疫获得的抗体大多是识别整个蛋白而非特定修饰位点，对筛选的要求更高。使用传统的杂交瘤技术，对于浆细胞的保留率较低，无法有效进行筛选。
彩科生物建立了基于单细胞光导技术的单B细胞抗体筛选流程，设计了两轮筛选方案，先通过一轮以磷酸化多肽为靶标的正筛获得255个分泌阳性抗体的浆细胞，再通过一轮以非磷酸多肽为靶标的负筛验证排除非特异性抗体，共获得61个特异性结合于磷酸化多肽的hits。以上筛选过程规避了大量的假阳性浆细胞，保留了抗体的多样性，显著减少了后期抗体表达验证的工作量。
背景介绍
蛋白质的磷酸化是一种在生物机体内普遍存在的蛋白质活力和功能调控机制，有多达三分之一的细胞蛋白存在磷酸化修饰[1]。针对磷酸化蛋白的检测抗体或阻断抗体在科研和临床上有着广泛的用途[2]。由于蛋白质磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸等少数几种氨基酸残基上，特异性识别蛋白磷酸化位点的抗体筛选充满挑战。
实验人员通过传统的杂交瘤及噬菌体展示技术筛选磷酸化抗体时，往往需要以ELISA实验分步检测表达上清中分泌抗体对磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白的结合活性，这个过程十分耗费人力，且由于杂交瘤及噬菌体展示技术都存在筛选库容量的问题，并不是高效获得稀有抗体的方法。
上机筛选
实验人员在一张14K芯片中移入8320个单克隆的鼠浆细胞。并通过一轮正筛检测到255个具有Ag 1抗原微球结合活性的阳性微腔（图1A），排除反筛检测到的 185个与Ag 2抗原微球结合的微腔（图1B），得到61个特异性结合磷酸化多肽Ag 1的hits。两轮筛选共花费约1.5 h时间。对正筛+反筛-的微腔中浆细胞进行导出，以鼠B细胞重轻链扩增试剂盒（彩科生物）扩增抗体VH/VL基因，最终获得37对非重复的抗体VH/VL基因序列。
图1. LyTARS™平台检测分泌抗体与两种抗原多肽的结合。(A) 假阳性微腔的正筛与反筛结果；(B)阳性微腔的正筛与反筛结果。阳性微腔表现为正筛+反筛-，而假阳性微腔表现为正筛+反筛+。
总结
随着蛋白磷酸化位点检测愈趋广泛，实验人员对磷酸化抗体的需求也越来越大。彩科生物的实验人员基于自研的LyTARS™平台，在一张芯片上先后完成磷酸化多肽结合（正筛）与非磷酸化多肽结合（反筛）两轮检测，得到61个特异性结合磷酸化多肽的hits。相比于传统ELISA实验中需要在两倍数量的96孔板上花费两倍的时间来实现两轮筛选，实验人员基于LyTARS™平台仅需多花费40分钟就可以完成第二轮筛选。
查看全文
彩科生物
彩科生物（Lychix）是一家成立于2018年的创新型高科技企业，由两位留美归国博士联合创立。公司专注于高端生命科学仪器与核心技术的自主研发，为生命科学提供先进研究工具，致力于开发高效的技术平台以挖掘高分辨率的海量生命科学数据。凭借突出的创新能力和明确的市场潜力，公司已获得IDG资本、君联资本等知名投资机构的支持，累计融资规模达数亿元人民币。公司主营业务聚焦于两大方向：高端生命科学和体外诊断（IVD）解决方案。
作者最近更新
-
彩科生物亮相第十六届生命科学公共平台研讨会，单细胞光导与全光谱流式平台引燃热议彩科生物
07-17 13:00
-
科研封面成果｜依托彩科数字 ELISA 开展儿童哮喘多指标细胞因子检测彩科生物07-03 18:07
-
仑卡奈单抗国内重磅获批！彩科生物以精准检测助力阿尔茨海默病早诊早治彩科生物07-03 18:02
评论0条评论